Comment utiliser l'échographie pour la rupture cellulaire et l'extraction d'ADN/ARN?

Comment utiliser l'échographie pour la rupture cellulaire et l'extraction d'ADN/ARN?

L'échographie est une technologie efficace et couramment utilisée dans la rupture cellulaire et l'extraction d'acides nucléiques (ADN/ARN).Son principe de base est d'utiliser l'effet de cavitation et les vibrations mécaniques pour détruire la structure cellulaire et libérer les substances internesCe qui suit est une explication du mécanisme spécifique, du processus de demande et des principales précautions:

I. Principe et procédé de l'échographie pour la rupture cellulaire
Le noyau de la perturbation cellulaire est de détruire la membrane cellulaire (cellules animales) ou la paroi cellulaire + membrane cellulaire (plantes, bactéries, champignons, etc.) pour libérer des substances intracellulaires (comme les acides nucléiques,protéinesL'échographie accomplit ce processus par les mécanismes suivants:
1Principe de base: effet de cavitation
L'échographie est une onde mécanique à haute fréquence d'une fréquence supérieure à 20 kHz.une vibration à haute fréquence (généralement de 15 à 50 kHz) est générée, ce qui déclenche une cavitation dans le milieu liquide:

Les vibrations à haute fréquence provoquent la formation dans le liquide d'un grand nombre de petites bulles (bulles de cavitation) qui se dilatent et se compriment rapidement sous des changements de pression.et finalement éclate violemment (effondrement).
Lorsque les bulles éclatent, une énorme quantité d'énergie instantanée (température locale élevée, pression élevée et fortes ondes de choc) est libérée,et la force d'impact générée déchirera directement la structure de membrane de la cellule (membrane cellulaire, paroi cellulaire) pour obtenir une fragmentation cellulaire.
2Effets auxiliaires: vibrations mécaniques et force de cisaillement
La vibration mécanique à haute fréquence des ultrasons générera également directement une force de cisaillement et une force de frottement sur les cellules, aidant ainsi à détruire la structure cellulaire,spécialement pour les cellules à paroi cellulaire épaisse (comme les champignons et les cellules végétales).
3. procédé de fragmentation (en prenant comme exemple l'opération expérimentale)
Mettre la suspension cellulaire à traiter (comme le fluide de culture bactérienne, l' homogénéité tissulaire, etc.) dans un tube ou un bol de centrifugeuse, insérer la sonde à ultrasons (corne),et la sonde doit être immergée dans le liquide mais pas en contact avec la paroi du conteneur.

Activez l'instrument à ultrasons et réglez les paramètres (puissance, temps, etc.): les vibrations à haute fréquence génèrent des bulles de cavitation dans le liquide,et la force d'impact générée par l'éclatement des bulles détruit directement la structure cellulaire et libère des substances intracellulaires (y compris les acides nucléiques), protéines, métabolites, etc.).
2Application spécifique de l'échographie dans l'extraction d'ADN/ARN
Les principales étapes de l'extraction d'ADN/ARN comprennent: la perturbation cellulaire pour libérer des acides nucléiques → l'élimination des impuretés (protéines, lipides, polysaccharides, etc.) → la purification des acides nucléiques.Le rôle de l'échographie se concentre principalement sur la première étape - la rupture efficace des cellules et la libération d'acides nucléiquesLes scénarios d'application spécifiques et les avantages sont les suivants:
1. Types d'échantillons appropriés
L'échographie est adaptée à l'extraction d'acides nucléiques de divers échantillons, notamment:

Tissus animaux (tels que le foie, les muscles): doivent être coupés en petits morceaux d'abord, l'échographie peut rapidement perturber les cellules et libérer des acides nucléiques;
Les bactéries/les champignons: les parois cellulaires sont relativement dures, les méthodes traditionnelles (telles que le traitement par lysozyme) sont inefficaces et les ultrasons peuvent détruire les parois cellulaires par un fort effet de cavitation;
Cellules en culture (cellules adhésives ou en suspension): suspension directe puis échographie, aucun prétraitement complexe n' est nécessaire;
Tissus végétaux: contient de la cellulose et de la pectine, les ultrasons peuvent aider à briser les parois cellulaires et à libérer le contenu cellulaire.
2Paramètres clés en fonctionnement (affectant la qualité des acides nucléiques)
Le traitement par ultrasons nécessite un contrôle strict des paramètres afin d'éviter la dégradation des acides nucléiques ou une fragmentation excessive (affectant les expériences ultérieures, telles que la PCR, le séquençage, etc.):

Puissance: généralement 50 à 300 W (ajustée en fonction du type d'échantillon, par exemple les bactéries nécessitent une puissance plus élevée).et une puissance trop faible entraînera une fragmentation insuffisante.
Temps de travail/intervalle: Use "pulse" treatment (such as working 30 seconds + intermission 30 seconds) to avoid continuous ultrasonic heat generation leading to nucleic acid denaturation (DNA/RNA is easily degraded at high temperature).
Temps total de traitement: dépend de l'échantillon (par exemple 1 à 3 minutes pour les cellules animales et 3 à 5 minutes pour les bactéries).
Contrôle de la température: bain de glace tout au long du processus (les échantillons sont placés sur la glace), car le processus ultrasonique générera de la chaleur (effet de cavitation accompagné d'une température locale élevée),une température basse peut inhiber l'activité de la nucléase et protéger la stabilité des acides nucléiques.

3. Avantages et précautions
Les avantages
Haute efficacité: plus rapide que les méthodes traditionnelles (telles que le broyage, la congélation et la décongélation répétées, l'hydrolyse enzymatique) (généralement réalisée en quelques minutes) et une perturbation plus approfondie;
Universalité: applicable à une variété de types d'échantillons (animaux, plantes, micro-organismes, etc.);
Facile à utiliser: aucun réactif complexe n'est nécessaire, seuls des instruments à ultrasons et un équipement de centrifugation de base sont nécessaires.
Précautions à prendre
Évitez les bulles: s'il y a un grand nombre de bulles dans l'échantillon, l'efficacité de l'effet de cavitation sera réduite et la sonde peut surchauffer.Assurez-vous que la sonde est complètement immergée dans le liquide (le niveau du liquide est d'environ 1 à 2 cm);
Inhibition de la nucléase: après rupture, une solution de lysis (y compris EDTA, détergent, etc.) doit être ajoutée à temps pour inhiber les nucléases intracellulaires (comme la RNase qui dégrade facilement l'ARN);
Volume de l'échantillon: le volume de traitement unique ne doit pas être trop grand (généralement ≤ 5 ml), sinon la distribution de l'énergie ultrasonique sera inégale et l'effet de perturbation sera très variable.

Résumé
L'échographie perturbe efficacement les cellules par l'effet de cavitation et la vibration mécanique, fournissant une "étape de libération" clé pour l'extraction d'ADN/ARN.temps et température pour perturber complètement les cellules tout en maximisant la protection de l'intégrité des acides nucléiquesCette technologie est largement utilisée dans la phase de pré-traitement des expériences de biologie moléculaire (telles que le clonage des gènes, la QPCR, l'analyse du transcriptome, etc.).) et est un outil important pour l'extraction d'acides nucléiques.